大豆类胡萝卜素裂解双加氧酶GmCCD8固氮功能解析

doi:10.13304/j.nykjdb.2020.1033

摘要/Abstract

摘要：

大豆可与根瘤菌共生进行生物固氮，固氮机制受许多基因诱导调控，类胡萝卜素裂解双加氧酶（carotenoid cleavage dioxygenases， CCDs）可调控多种植物激素、色素、芳香类化合物的合成与代谢。为探讨其在大豆生物固氮中的功能，从大豆育成品种中黄15中克隆类胡萝卜素裂解双加氧酶GmCCD8基因，分析了该基因的表达模式及生物学功能。亚细胞定位表明GmCCD8在细胞质中表达。qRT-PCR技术及启动子融合GUS表达载体转化大豆毛状根，发现GmCCD8随大豆根瘤生长发育表达量逐渐上升，且在第28天根瘤中表达量最高。通过构建过表达及RNAi转基因复合植株，验证了GmCCD8影响根瘤发育及固氮能力。利用透射电镜观察根瘤内部结构，发现GmCCD8被干扰后根瘤内泡囊、类菌体和聚β?羟基丁酸盐的含量明显减少。上述结果表明，GmCCD8参与大豆根瘤生长发育及生物固氮过程，为大豆高效固氮分子育种提供了功能基因。

关键词: 大豆, 根瘤, 共生固氮, 类胡萝卜素裂解双加氧酶, 大豆GmCCD8

Abstract:

Soybean interacts with rhizobia in the soil to fix the atmospheric nitrogen. The symbiotic nitrogen fixation process is complex and a series of genes are induced during nodule development. The carotenoid cleavage dioxygenases （CCDs） regulates anabolic metabolism of various plant hormones， pigments and aromatic compounds. In order to investigate the function of CCDs in biological nitrogen fixation， this study cloned GmCCD8 from soybean cultivar ZH15 to analyze its expression pattern and biological function. GmCCD8 was localized in cytoplasm. The expression pattern of GmCCD8 in soybean nodules were analyzed by qRT-PCR and histochemical GUS staining in transgenic soybean hairy roots and its expression increased during nodule development picked at 28^th day. By analyzing composite transgenic soybean root nodules， GmCCD8 was found to affecte nodule fresh weight and nitrogenase activity. Ultrastructure of GmCCD8 RNAi nodules showed that the formation of vesicle， bacteroids and poly?β?hydroxybutyrate （PHB） in the root nodule was significantly reduced. The above results indicated that GmCCD8 was involved in soybean nodule development and nitrogen fixation， which provided functional genes for molecular breeding with efficient nitrogen fixation ability in soybean.

Key words: soybean, nodules, symbiotic nitrogen fixation, carotenoid cleavage dioxygenase, GmCCD8

中图分类号:

S565.1

邢馨竹, 杨占武, 孔佑宾, 李文龙, 杜汇, 李喜焕, 张彩英. 大豆类胡萝卜素裂解双加氧酶GmCCD8固氮功能解析[J]. 中国农业科技导报, 2022, 24(1): 46-53.

Xinzhu XING, Zhanwu YANG, Youbin KONG, Wenlong LI, Hui DU, Xihuan LI, Caiying ZHANG. Functional Analysis of Carotenoid Cleavage Dioxygenases GmCCD8 in Soybean Nodulation[J]. Journal of Agricultural Science and Technology, 2022, 24(1): 46-53.

图/表 6

表1 本研究所用引物

Table 1 Primers used in this study

引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence（ 5’- 3’）
GmCCD8-GFP	F： CTTGTCTAGAGTATGCTTGTTCCTGACATG
GmCCD8-GFP	R： CGGGGGATCCACTCTTTTGGAACCCA
GmCCD8-GUS	F： GATCCACATGATTGATGATATTTTAGTC
GmCCD8-GUS	R： AATGGGTTTACTCCACTTTTCTGCAT
GmCCD8	F： TTCTCTAGAGCTTCCCTGACCGACAAC
GmCCD8	R： ACCTTGTTGTTAGGATGGAAGCTTGTA
Actin11	F：ATCTTGACTGAGCGTGGTTATTCC
Actin11	R：GCTGGTCCTGGCTGTCTCC

图1 GmCCD8根瘤表达量

Fig.1 Relative expression of GmCCD8 in nodules

图2 GmCCD8在拟南芥原生质体中亚细胞定位

Fig.2 Subcellular localization of GmCCD8 in Arabidopsis protoplasts

图3 转GmCCD8启动子的阳性根瘤不同发育时期GUS染色

Fig.3 Histochemical GUS staining of nodules with GmCCD8 promoter in different developmental stages

图4 GmCCD8转基因复合植株根瘤表型及指标分析A：根瘤表型；B： GmCCD8表达量分析；C：固氮酶活活性；D：根瘤鲜重

Fig.4 Index and phenotypic of nodules in GmCCD8 transgenic composite plantsA： Phenotypic analysis； B： Expression of GmCCD8； C： Nitrogenase activity； D： Nodule fresh weight

图5 GmCCD8 RNAi 28 d根瘤显微结构注：VE－泡囊； NB－根瘤类菌体；PHB－聚β-羟基丁酸盐。

Fig.5 Nodule ultrastructure of GmCCD8 RNAi at 28 dNote：VE—Vesicle； NB—Nodule bacteroid； PHB—Poly-β-hydroxy-butyrate.

参考文献 34

1	杨红旗，郝仰坤.我国大豆产业回顾、现状与发展对策［J］.广东农业科学， 2010， 37（1）： 188-191.
	YANG H Q， HAO Y K. Historical review， current situation and development countermeasure of Chinese soybean ［J］. Guangdong Agric. Sci.， 2010， 37（1）： 188-191.
2	姚玉波，马春梅，张磊，等.施氮水平对大豆吸收利用氮素及产量的影响［J］.东北农业大学学报， 2009， 40（4）： 6-10.
	YAO Y B， MA C M， ZHANG L， et al.. Effect of nitrogen levels on absorption and utilization of nitrogen and yield of soybean ［J］. J. Northeast Agric.Univ.， 2009， 40（4）： 6-10.
3	MURRAY J D， LIU C W， CHEN Y， et al.. Nitrogen sensing in legumes ［J］. J. Exp. Bot.， 2016， 68（8）：1919-1926.
4	侯云龙，高淑芹，马晓萍，等.大豆根瘤共生固氮分子机制研究进展［J］.农业与技术， 2017， 37（21）： 34-36.
5	郝天雪.大豆根瘤菌的侵染、根瘤形成过程的研究［D］.哈尔滨：东北农业大学， 2017.
	HAO T X. The study on the infection of soybean rhizobium and the formation of soybean root nodule ［D］. Harbin： Northeast Agricultural University， 2017.
6	TRAINER M A， CHARLES T C. The role of PHB metabolism in the symbiosis of rhizobia with legumes ［J］. Appl. Microb. Biotechnol.， 2006， 71（4）： 377-386.
7	AULDRIDGE M E， MCCARTY D R， KLEE H J. Plant carotenoid cleavage oxygenases and their apocarotenoid products ［J］. Curr. Opin. Plant Biol.， 2006， 9（3）： 315-321.
8	KUN-PENG J ， LINA B ， SALIM A B. From carotenoids to strigolactones ［J］. J. Exp. Bot.， 2018，69（9）：2189-2204.
9	HARRISON P J， BUGG T D H. Enzymology of the carotenoid cleavage dioxygenases： reaction mechanisms， inhibition and biochemical roles ［J］. Arch. Biochem. Biophys.， 2014， 544： 105-111.
10	SCHWARTZ S H， TAN B C， GAGE D A， et al.. Specific oxidative cleavage of carotenoids by VP14 of maize ［J］. Science， 1997， 276（5320）： 1872-1874.
11	TANBC， JOSEPH L M， DENG W T， et al.. Molecular characterization of the Arabidopsis 9-cis epoxycarotenoid dioxygenase gene family ［J］. Plant J.， 2003， 35（1）：45-56.
12	FLOSS D S， SCHLIEMANN W， SCHMIDT J， et al.. RNA interference-mediated repression of MtCCD1 in mycorrhizal roots of Medicago truncatula causes accumulation of C27 apocarotenoids， shedding light on the functional role of CCD1 ［J］. Plant Physiol.， 2008， 148（3）： 1267-1282.
13	CAWLY J， COLE A B， KIRáLY L， et al.. The plant gene CCD1 selectively blocks cell death during the hypersensitive response to Cauliflower mosaic virus infection ［J］. Mol. Plant-microbe Int.， 2005， 18（3）： 212-219.
14	LóPEZJaviera， ESSUS K， KIM I K， et al.. Production of β-ionone by combined expression of carotenogenic and plant CCD1 genes in Saccharomyces cerevisiae ［J/OL］. Microb. Cell Factories， 2015， 14（1）： 84 ［2021-04-15］. .
15	HUANG F C， PéTER M， WILFRIED S. Cloning and functional characterization of carotenoid cleavage dioxygenase 4 genes ［J］. J. Exp. Bot.， 2009， 60（11）： 3011-3022.
16	FUKAMATSU Y， TAMURA T， HIHARA S， et al.. Mutations in the CCD4 carotenoid cleavage dioxygenase gene of yellow-flesh peaches ［J］. Bioence Biotechnol. Biochem.， 2013， 77（12）： 2514-2516.
17	ZHENG X， ZHU K， SUN Q， et al.. Natural variation in CCD4 promoter underpins species-specific evolution of red coloration in citrus peel ［J］. Mol. Plant， 2019， 12（9）： 1294-1307.
18	HAN Y J， WANG H Y， WANG X D， et al.. Mechanism of floral scent production in Osmanthus fragrans and the production and regulation of its key floral constituents， β-ionone and linalool ［J/OL］. Hortic. Res.， 2019， 106 ［2021-04-15］. .
19	AULDRIDGE M E， BLOCK A， VOGEL J T， et al.. Characterization of three members of the Arabidopsis carotenoid cleavage dioxygenase family demonstrates the divergent roles of this multifunctional enzyme family ［J］. Plant J.， 2006， 45（6）：982-953.
20	WANG Y X， SHANG L G， YU H， et al.. A strigolactone biosynthesis gene contributed to the green revolution in rice ［J］. Mol. Plant， 2020， 13（6）： 923-932.
21	LIANG Y S， JEON Y A， LIM S H， et al.. Vascular-specific activity of the Arabidopsis carotenoid cleavage dioxygenase 7 gene promoter ［J］. Plant Cell Rep.， 2011， 30（6）： 973-980.
22	纠松涛，徐岩，张才喜，等.独脚金内酯及其调控植物根系生长发育的研究进展［J/OL］.分子植物育种，2021， 19（15）： 5164-5171.
	JU S T， XU Y， ZHANG C X， et al.. Reasearch advancements on strigolactones and its regulatory effect on root growth and development in plants ［J/OL］. Mol. Plant Breed.， 2021， 19（15）： 5164-5171.
23	PASARE S A， DUCREUX L J M， MORRIS W L， et al.. The role of the potato （Solanum tuberosum） CCD8 gene in stolon and tuber development ［J］. New Phytol.， 2013， 198（4）：1108-1120.
24	WANG Y， YANG Z W， KONG Y B， et al.. GmPAP12 is required for nodule development and nitrogen fixation under phosphorus starvation in soybean ［J/OL］. Front. Plant Sci.， 2020， 11：450 ［2021-04-15］. .
25	李和平.植物显微技术［M］. 第二版.北京：科学出版社，2009：90-95，115
26	KIM Y K， KIM S， UM J H， et al.. Functional implication of β-carotene hydroxylases in soybean nodulation ［J］. Plant Physiol.， 2013， 162（3）： 1420-1433.
27	ZHANG Y， CHENG X， WANG Y， et al.. The tomato MAX1 homolog， SlMAX1， is involved in the biosynthesis of tomato strigolactones from carlactone ［J］. New Phytol.， 2018， 219（1）：297-309.
28	PELÁEZ-VICO M A， BERNABéU-RODA L， KOHLEN W， et al.. Strigolactones in the rhizobium-legume symbiosis： stimulatory effect on bacterial surface motility and down-regulation of their levels in nodulated plants ［J］. Plant Sci.， 2016， 245：119-127.
29	SOTO M J， FERNANDEZ-APARICIO M， CASTELLANOS-MORALES V， et al.. First indications for the involvement of strigolactones on nodule formation in alfalfa （Medicago sativa）［J］. Soil Biol. Biochem.， 2010， 42（2）： 383-385.
30	FOO E， DAVIES N W. Strigolactones promote nodulation in pea ［J］. Planta， 2011， 234： 1073-1081.
31	DE CUYPER C， FROMENTIN J， YOCGO R E， et al.. From lateral root density to nodule number， the strigolactone analogue GR24 shapes the root architecture of Medicago truncatula ［J］. J. Exp. Bot.， 2015， 66： 137-146.
32	KUMAR B V， ABU N J， MARZOUK K S， et al.. CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of CAROTENOID CLEAVAGE DIOXYGENASE 8 in tomato provides resistance against the parasitic weed Phelipanche aegyptiaca ［J/OL］. Sci. Rep.， 2019， 9（1）：11438 ［2021-04-15］. .
33	LIU J， NOVERO M， CHARNIKHOVA T， et al.. Carotenoid cleavage dioxygenase 7 modulates plant growth， reproduction， senescence， and determinate nodulation in the model legume Lotus japonicus［J］. J. Exp. Bot.， 2013， 64： 1967-1981.
34	TRAINER M A， CHARLES T C. The role of PHB metabolism in the symbiosis of rhizobia with legumes ［J］. Appl. Microb. Biotechnol.， 2006， 71（4）： 377-386.

[1]	范文华, 戴建军, 张树山, 孙玲伟, 吴彩凤, 张德福. 大豆卵磷脂稀释液中添加原花青素对山羊冻精效果的影响#br#[J]. 中国农业科技导报, 2021, 23(9): 78-86.
[2]	陈士亮, 孙亚倩, 邵振启, 李文龙, 孔佑宾, 杜汇, 李喜焕, 张彩英. 大豆鲜荚籽粒上位性QTL及其互作效应分析[J]. 中国农业科技导报, 2021, 23(8): 25-36.
[3]	张永芳，高志慧，史鹏清，韩志平*. 基于不同大豆品种农艺性状及品质性状的适应性分析[J]. 中国农业科技导报, 2020, 22(8): 25-32.
[4]	李智，王宏富*，王钰云，杨净，鱼冰星，黄珊珊. 谷子大豆间作对作物光合特性及产量的影响[J]. 中国农业科技导报, 2020, 22(6): 168-175.
[5]	隋傅1,2,刘晓琳1,2,解志红1,3*. 茎瘤固氮根瘤菌ORS571受体TlpA1对琥珀酸的感应机理[J]. 中国农业科技导报, 2020, 22(10): 77-84.
[6]	金林雪1,唐红艳1*,武荣盛1,王惠贞1,刘林春2. 内蒙古大豆干旱灾害风险分析与区划[J]. 中国农业科技导报, 2020, 22(1): 106-115.
[7]	白玉哲1,马钰聪1,孟一泽1,廉瑞娇1,王莹1,李喜焕1,张彩英2. 大豆籽粒蛋白与脂肪含量上位性QTLs分析[J]. 中国农业科技导报, 2019, 21(6): 36-42.
[8]	张丽梅,马欣,韩宝吉,石磊*. 大豆-油菜轮作中不同硼肥及后效对作物产量的影响[J]. 中国农业科技导报, 2019, 21(10): 133-139.
[9]	曹慧方,李新新,张玥琦,石鹏君,柏映国,姚斌. 来源于脂环酸芽孢杆菌的GH1家族β-葡萄糖苷酶的葡萄糖耐受性分子改造[J]. 中国农业科技导报, 2018, 20(5): 26-33.
[10]	耿金剑,王春艳*,程婉莹,杨雪玲,李茂松. 极早熟区大豆冠层受光量及其对产量的影响[J]. 中国农业科技导报, 2018, 20(5): 111-123.
[11]	孟强1§,姜奇彦2§,牛风娟2,孙现军2,胡正2,张辉2*. 盐胁迫下不同抗性野生大豆（Glycine soja）生理生化性状比较分析[J]. 中国农业科技导报, 2017, 19(8): 25-32.
[12]	刘渊1,李文龙1,李喜焕1,王瑞霞2,常文锁1,张彩英1,3*. 施肥水平和种植密度对河北山区夏播大豆产量及品质影响[J]. 中国农业科技导报, 2017, 19(8): 115-123.
[13]	孔佑宾1,王冰1,张华1,刘渊1,李喜焕1,张彩英2. 植物蛋白融合HA标签通用载体构建与应用[J]. 中国农业科技导报, 2017, 19(6): 131-137.
[14]	刘渊1,李文龙1,李喜焕1,王瑞霞2,常文锁1,张彩英1,3*. 河北省北部山区大豆丰产高效栽培技术探索[J]. 中国农业科技导报, 2016, 18(4): 101-108.
[15]	杨柳青1§,刘浩然1§,孙国伟2,张书玲1,董丽君1,. 干旱胁迫对不同抗旱大豆品种生理特性及生长参数的影响[J]. 中国农业科技导报, 2016, 18(2): 115-120.