中国农业科技导报 ›› 2019, Vol. 21 ›› Issue (7): 161-169.DOI: 10.13304/j.nykjdb.2019.0094
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张明明1,2§,刘丽华2§,赵建宗3,张力科3,刘阳娜2,李宏博2,张风廷2,姚骥4,庞斌双2*,赵昌平2*
ZHANG Mingming1,2§, LIU Lihua2§, ZHAO Jianzong3, ZHANG Like3, LIU Yangna2, LI Hongbo2, ZHANG Fengting2, YAO Ji4, PANG Binshuang2*, ZHAO Changping2*
摘要: 以小麦种子分子检测农业行业标准(NY/T 2859-2015)为基础,开发小麦种子快速、规模化提取DNA方法,优化反应体系中各组分含量,为小麦真实性快速执法提供技术支撑。通过对SDS、CTAB、高盐低pH、快速提取和试剂盒5种方法提取的DNA质量、浓度和PCR扩增效果进行比较,发现改进的高盐低pH方法提取种子的DNA质量、浓度能够满足小麦真实性鉴定中42对SSR引物重复鉴定的需求,是利用96孔深孔板和自动化移液工作站规模化、高通量提取DNA的较优方法。进一步优化结果显示该方法在65℃温浴条件下比室温的浓度高出25%,但两种温度条件下提取的DNA质量及浓度均能够满足品种鉴定的需求;沉淀时用0.5倍提取液体积的预冷异丙醇沉淀浓度最高,用室温的异丙醇沉淀的最佳体积是提取液体积的0.6倍。对标准中42对引物的最佳引物浓度和模板浓度均进行了优化,综合所有42对引物的优化结果发现,反应体系为20 μL时,引物终浓度为0.437 5 μmol/L,模板终浓度为10 ng/μL时扩增效率相对较高,扩增产物稳定,能够满足多重电泳的需求。