Molecular Characterizations of Stacked Transgenic Maize BBHTL8-1 with Insect Resistance， Glyphosate Tolerance and Improved Quality

doi:10.13304/j.nykjdb.2020.0703

Abstract

Abstract:

With the development of genetically modified crops， transgenic plants containing stacked traits become more and more popular. Transgenic maize plants with stacked traits are usually insect resistance and herbicide tolerance. Here， BBHTL8-1 transgenic maize line containing Cry1Ab， Cry3Bb， cp4epsps， ZmHPT and ZmTMT expressing cassettes was obtained to confer transgenic maize plants with insect resistance， glyphosate tolerance and improved α-tocopherol content traits. In BBHTL8-1 transgenic line， all 5 genes were integrated in the maize genome and could be identified in different generations. Whole genome sequencing and flanking sequence analysis showed that the insertion fragment was located in the intergenic region of chromosome 4， with 31 bp deletion in the 3’ flank sequence. Cry1Ab， Cry3Bb and cp4epsps showed relatively stable expression levels in different development stages of root， stem and leaf， and had lower expression levels in the seeds， whereas ZmHPT and ZmTMT had higher expression levels in the seeds. Evaluations of insect resistance and glyphosate tolerance revealed that BBHTL8-1 plants were highly resistant to Asian corn borer， and were highly tolerant to glyphosate. The α-tocopherol content in BBHTL8-1 seeds was significantly higher than in non-transgenic plants Zheng 58. There were no significant differences between BBHTL8-1 and Zheng 58 on agronomic traits under normal growth condition. Above results obtained a new transgenic maize line with stacked traits on insect resistance， herbicide tolerance and nutritional quality improvement， which might be developed for transgenic breeding.

Key words: transgenic maize, stacked trait, insect resistance, herbicide tolerance, α-tocopherol, molecular characterization

摘要：

随着转基因作物的发展和推广，具有复合性状的转基因作物种植面积逐年增加。传统的转基因复合性状作物具有抗虫和耐除草剂性能，聚合其他性状的转基因作物培育逐渐受到重视。转基因玉米株系BBHTL8-1含有Cry1Ab、Cry3Bb、cp4epsps、ZmHPT和ZmTMT共5个基因表达框，外源插入片段位于玉米基因组第4染色体，插入基因区间，在3’侧翼序列有31 bp缺失。在BBHTL8-1中，这5个基因能够稳定遗传，在转录水平和蛋白水平上表达具有稳定性。BBHTL8-1高抗玉米螟，对草甘膦除草剂具有较高耐受性。BBHTL8-1籽粒中α-生育酚含量比非转基因对照郑58显著增加。BBHTL8-1与非转基因对照郑58在田间农艺性状方面无显著差异。因此，BBHTL8-1为转基因抗虫、耐除草剂和种子具有高α-生育酚含量的转基因新材料。

关键词: 转基因玉米, 复合性状, 抗虫, 耐除草剂, α-生育酚, 分子特征

CLC Number:

S513

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Figures/Tables 10

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引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence （5’-3’）	片段大小 Fragment size/bp	说明 Explanation
Cry1Ab-1F	CTACTTGTACCAGAAGATCGAC	356	Cry1Ab片段鉴定
Cry1Ab-1R	GACCGGCAACAGGATTCAATC	356	Cry1Ab fragment identification
Cry3Bb-1F	CTGCTCTTCCTGAAGGAGTCG	432	Cry3Bb片段鉴定
Cry3Bb-1R	CAGACTCGCAAGAACTCGCAC	432	Cry3Bb fragment identification
cp4epsps-1F	ACCCATCTCGATCACCGCAT	262	cp4epsps片段鉴定
cp4epsps-1R	CTCAACACATGAGCGAAACCC	262	cp4epsps fragment identification
ZmHPT-1F	CAACTCTTCCATTGGCATCT	750	ZmHPT片段鉴定
Tglb1-1R	AGGCTCATGCTACGTACGCA	750	ZmHPT fragment identification
ZmTMT-1F	TGGTGGTAGCTCAAGGTACT	716	ZmTMT片段鉴定
Tglb1-1R	AGGCTCATGCTACGTACGCA	716	ZmTMT fragment identification
BBHTL8-1-3F	TGATTAGAGTCCCGCAATTAT	240	BBHTL8-1片段特异性PCR
BBHTL8-1-3R	GATTAGTTGAGCGGTGGCAAC	240	BBHTL8-1 fragment specific PCR
Cry1Ab-qF	CTACTTGTACCAGAAGATCGAC	256	Cry1Ab qRT-PCR
Cry1Ab-qR	TCAGTCCTCGTTCAGGTCGGTG	256	Cry1Ab qRT-PCR
Cry3Bb-qF	CTGCTCTTCCTGAAGGAGTCG	327	Cry3Bb qRT-PCR
Cry3Bb-qR	GATGAACTCGATCTTGTCGATG	327	Cry3Bb qRT-PCR
cp4epsps-qF	ACCCATCTCGATCACCGCA	166	cp4epsps qRT-PCR
cp4epsps-qR	CAGCCTTCGTATCGGAGAGTTC	166	cp4epsps qRT-PCR
ZmHPT-qF	CTACCTCTTCCTGTTTGTGGAGCA	252	ZmHPT qRT-PCR
Tglb1-qR	CTCATGCTACGTACGCACGTCG	252	ZmHPT qRT-PCR
ZmTMT-qF	CGTGATAAAATCAGCGCTAACAT	233	ZmTMT qRT-PCR
Tglb1-qR	CTCATGCTACGTACGCACGTCG	233	ZmTMT qRT-PCR
ZmAct1-qF	CACCTTCTACAACGAGCTCCG	404	ZmAct1 qRT-PCR
ZmAct1-qR	TAATCAAGGGCAACGTAGGCA	404	ZmAct1 qRT-PCR

引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence （5’-3’）	片段大小 Fragment size/bp	说明 Explanation
Cry1Ab-1F	CTACTTGTACCAGAAGATCGAC	356	Cry1Ab片段鉴定
Cry1Ab-1R	GACCGGCAACAGGATTCAATC	356	Cry1Ab fragment identification
Cry3Bb-1F	CTGCTCTTCCTGAAGGAGTCG	432	Cry3Bb片段鉴定
Cry3Bb-1R	CAGACTCGCAAGAACTCGCAC	432	Cry3Bb fragment identification
cp4epsps-1F	ACCCATCTCGATCACCGCAT	262	cp4epsps片段鉴定
cp4epsps-1R	CTCAACACATGAGCGAAACCC	262	cp4epsps fragment identification
ZmHPT-1F	CAACTCTTCCATTGGCATCT	750	ZmHPT片段鉴定
Tglb1-1R	AGGCTCATGCTACGTACGCA	750	ZmHPT fragment identification
ZmTMT-1F	TGGTGGTAGCTCAAGGTACT	716	ZmTMT片段鉴定
Tglb1-1R	AGGCTCATGCTACGTACGCA	716	ZmTMT fragment identification
BBHTL8-1-3F	TGATTAGAGTCCCGCAATTAT	240	BBHTL8-1片段特异性PCR
BBHTL8-1-3R	GATTAGTTGAGCGGTGGCAAC	240	BBHTL8-1 fragment specific PCR
Cry1Ab-qF	CTACTTGTACCAGAAGATCGAC	256	Cry1Ab qRT-PCR
Cry1Ab-qR	TCAGTCCTCGTTCAGGTCGGTG	256	Cry1Ab qRT-PCR
Cry3Bb-qF	CTGCTCTTCCTGAAGGAGTCG	327	Cry3Bb qRT-PCR
Cry3Bb-qR	GATGAACTCGATCTTGTCGATG	327	Cry3Bb qRT-PCR
cp4epsps-qF	ACCCATCTCGATCACCGCA	166	cp4epsps qRT-PCR
cp4epsps-qR	CAGCCTTCGTATCGGAGAGTTC	166	cp4epsps qRT-PCR
ZmHPT-qF	CTACCTCTTCCTGTTTGTGGAGCA	252	ZmHPT qRT-PCR
Tglb1-qR	CTCATGCTACGTACGCACGTCG	252	ZmHPT qRT-PCR
ZmTMT-qF	CGTGATAAAATCAGCGCTAACAT	233	ZmTMT qRT-PCR
Tglb1-qR	CTCATGCTACGTACGCACGTCG	233	ZmTMT qRT-PCR
ZmAct1-qF	CACCTTCTACAACGAGCTCCG	404	ZmAct1 qRT-PCR
ZmAct1-qR	TAATCAAGGGCAACGTAGGCA	404	ZmAct1 qRT-PCR

组织材料Material		死亡率Mortality rate/%
组织材料Material		2 d	4 d	6 d
BBHTL8-1	心叶 Whorl leaf	63±3	85±4	100
	花丝 Silk	65±3	73±4	100
	籽粒 Seed	60±2	71±3	100
郑58 Zheng 58	心叶Whorl leaf	0	0	5±1

组织材料Material		死亡率Mortality rate/%
组织材料Material		2 d	4 d	6 d
BBHTL8-1	心叶 Whorl leaf	63±3	85±4	100
	花丝 Silk	65±3	73±4	100
	籽粒 Seed	60±2	71±3	100
郑58 Zheng 58	心叶Whorl leaf	0	0	5±1

材料 Material	α-生育酚 α-tocopherol	γ-生育酚 γ-tocopherol	δ-生育酚 δ-tocopherol
郑58 Zheng 58	0.71±0.11	5.27±0.22	2.20±0.18
BBHTL8-1（BC₄F₁）	9.59±0.53	0.29±0.06	0.08±0.01
郑58 Zheng 58	1.51±0.19	4.27±0.22	1.20±0.12
BBHTL8-1（BC₅F₁）	8.59±1.53	0.46±0.16	0.04±0.01
郑58 Zheng 58	1.81±0.19	4.22±0.22	1.22±0.12
BBHTL8-1（BC₆F₁）	8.21±0.69	0.32±0.12	0.14±0.03