转基因复合抗虫耐除草剂玉米BFL4-1的分子特征及功能评价

doi:10.13304/j.nykjdb.2020.0111

摘要/Abstract

摘要：

玉米螟和田间杂草严重影响我国玉米的生长发育，导致玉米产量和品质下降。培育具有抗虫、耐除草剂等复合性状的转基因玉米成为转基因玉米育种的一个趋势。将cry1Ab、cry1F和cp4epsps构建在同一载体上并利用农杆菌转化到玉米Hi-II中，通过与玉米自交系郑58进行回交转育，获得了具有郑58遗传背景并兼具抗虫和耐除草剂性状的转基因玉米株系BFL4-1。全基因组高通量测序和侧翼序列测序分析表明，BFL4-1中目的基因插入片段位于第3染色体基因间区，为单一插入位点。转录水平和蛋白水平检测结果表明，cry1Ab、cry1F和cp4epsps在不同组织中均能稳定表达。田间玉米螟接虫和喷施草甘膦试验表明，BFL4-1株系高抗玉米螟并且对草甘膦具有较好的耐受性，与对照相比在农艺性状方面无显著差异。由此表明，获得的BFL4-1为具有抗玉米螟和耐草甘膦除草剂复合性状的转基因玉米新材料。

关键词: 转基因玉米, 抗虫, 耐除草剂, 复合性状, 分子特征, 遗传稳定性

Abstract:

Ostrinia furnacalis （Asian corn borer） and weeds seriously affect maize growth， development and production in China. Transgenic stacking maizes with insect and herbicide resistance traits have become the main trend of transgenic maize breeding. cry1Ab， cry1F and cp4epsps were introduced into maize Hi-II mediated by Agrobacteria. After backcrossing with maize inbred line Zheng 58 and then self-pollination， one transgenic line named BFL4-1 was obtained. Through whole genome sequencing and flanking sequence analysis， there was one insertion in BFL4-1 and the insertion fragment was located in the intergenic region of chromosome 3. In BFL4-1 plants， cry1Ab， cry1F and cp4epsps were detected in different tissues on transcription and protein levels. Field experiments revealed that the BFL4-1 transgenic plants were highly resistant to Asian corn borer and more tolerant to glyphosate. There were no significant differences between BFL4-1 and the control （Zheng 58） on agronomic traits. Above results showed that BFL4-1 line could be served as a new maize transgenic line with stacked traits showing high resistance to insect and glyphosate.

Key words: transgenic maize, insect resistance, herbicide resistance, stacking trait, molecular characterization, stability of inheritance

中图分类号:

S513

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图/表 6

图1 cry1Ab、cry1F和cp4epsps插入表达框的结构注：RB—右边界序列；Tnos—Nos终止子；OsAct2 Intron—水稻Actin2第1内含子；E35S—增强型花椰菜花叶病毒35S启动子；OsAct2 pro—水稻Actin2启动子；CTP2—AtEPSPS信号肽；Thsp17—小麦的热激蛋白Hsp17终止子；Ubi pro—玉米泛素蛋白基因启动子；T35S—花椰菜花叶病毒35S终止子；LB—左边界序列。

Fig.1 Structure of T-DNA region containing cry1Ab， cry1F and cp4epsps expression cassettesNote：RB—Right border of T-DNA； Tnos—Nos terminator；OsAct2 Intron—1st intron of rice Actin2； E35S—Enhanced 35S promoter； OsAct2 pro—OsAct2 promoter； CTP2—AtEPSPS signal peptide； Thsp17—Wheat heat shock protein Hsp17 terminator； Ubi pro—Ubiquitin promoter； T35S—35S terminator； LB— Left border of T-DNA.

表1 本研究中引物序列

Table 1 Primers used in this study

引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence（5’-3’）	扩增片段大小Fragment size/bp	注释 Reference
cry1Ab-1F cry1Ab-1R	CTACTTGTACCAGAAGATCGAC GACCGGCAACAGGATTCAATC	356	cry1Ab 鉴定cry1Ab identification
cry1F-1F cry1F-1R	CTTACGTTCCAGTCCTTCTCC CTCAACACATGAGCGAAACCC	403	cry1F鉴定cry1F identification
cp4epsps-1F cp4epsps-1R	TCGATCACCGTATCGCTATGA CAGACTCGCAAGAACTCGCAC	254	cp4epsps 鉴定cp4epsps identification
BFL4-1-TF BFL4-1-TR	TAACCGTAGCAGGGGTAGTTAGTT TGTGTGAGTAGTTCCCAGATAAG	548	BFL4-1特异性检测 Specific detection of BFL4-1
cry1Ab-qF cry1Ab-qR cry1AF-qF cry1AF-qR cp4epsps-qF cp4epsps-qR zSSIIb-qF zSSIIb-qR	CTACTTGTACCAGAAGATCGAC TCAGTCCTCGTTCAGGTCGGTG CTTACGTTCCAGTCCTTCTC TCACTCATCTAGGCAGAACTCG TCGATCACCGTATCGCTATGA TCAAGCAGCCTTAGTGTCGGAG CGGTGGATGCTAAGGCTGATG AAAGGGCCAGGTTCATTATCCTC	256	qRT-PCR
		312
		164
		88

图2 在BFL4株系不同世代中cry1Ab、cry1F和cp4epsps片段PCR检测

Fig.2 PCR detection of cry1Ab， cry1F and cp4eps expression cassettes in different generations of BFL4 line

图3 cry1Ab、cry1F和cp4pesps相对表达量和免疫试纸条检测

Fig.3 Relative expression level of cry1Ab， cry1F， cp4pesps and immunostrip tests

图4 BFL4-1材料田间耐除草剂和抗虫性能评价A：玉米4～5叶期喷施草甘膦1周后生长情况；B：12叶期田间玉米螟抗虫性鉴定

Fig.4 Evaluation of herbicide tolerance and insect resistance of BFL4-1 plants in the fieldA： Growth of materials at 1 week after spraying glyphosate at 4~5 leaf stage； B： Evaluation of insect resistance at twelve-leaf stage

表2 BFL4-1与对照郑58农艺性状比较 (BFL4-1 and Zheng 58)

Table 2 Comparison of agronomic traits between

农艺性状Agronomic trait	郑58 Zheng 58	BFL4-1
生育周期Growth period/d	110±2.0	108±2.0
抽雄期Tasseling stage/d	59±2.0	58±2.0
株高Plant height/m	1.83±0.25	1.78±0.2
穗位高Ear height/m	0.85±0.15	0.84±0.1
穗行数Rows per era	14±0	14±0
行粒数Kernels per row	36.0±2.0	35.0±2.0
百粒重100-kernel weight/g	29.8±2.1	28.8±2.2
萌发率Germination rate/%	95.0±1.6	96.0±2.0

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