维生素C调节小鼠TM4支持细胞的功能和基因表达

doi:10.13304/j.nykjdb.2024.0583

摘要/Abstract

摘要：

为探究维生素C对小鼠TM4支持细胞的功能和基因表达影响，采用0、100、250和500 μmol·L^-1的L-抗坏血酸2-磷酸倍半镁水合盐（L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium，AA2P）处理小鼠TM4支持细胞不同时间，分析不同AA2P处理水平和处理时间下的细胞活力；进一步采用多种研究方法检测细胞的增殖、凋亡、活性氧（reactive oxygen species，ROS）水平、线粒体功能、RNA甲基化（m⁶A）和组蛋白H3三甲基化（H3K4me3、H3K9me3和H3K36me3）水平、抗苗勒氏管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）、雌二醇、乳酸以及基因表达的变化。结果表明，采用250 μmol·L^-1 AA2P处理TM4细胞36 h能显著提高细胞活力，促进细胞增殖，降低细胞早期凋亡和活性氧水平，增强线粒体功能，改变m⁶A水平和组蛋白H3三甲基化（H3K4me3、H3K9me3和H3K36me3）水平，促进AMH和雌二醇的分泌，降低乳酸水平。RNA-seq检测结果显示，250 μmol·L^-1 AA2P处理TM4细胞36 h诱导112个基因表达出现显著差异。GO（gene ontology）和KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes）富集到多条通路。综上表明，维生素C可调节小鼠TM4支持细胞的功能和基因表达。

关键词: 小鼠, TM4细胞, 维生素C, 转录组学, 信号通路

Abstract:

To investigate the effects of vitamin C on the function and gene expression of mouse TM4 Sertoli cells， the cells were treated with 0， 100， 250 and 500 μmol·L^-1 of L-ascorbic acid 2-phosphate magnesium hydrate （AA2P） for different time length. Cell viability under different treatments was used to select the optimal conditions for AA2P treatment of TM4 cells. Further， different methods were used to detect cell proliferation， apoptosis， reactive oxygen species （ROS） level， mitochondrial function， RNA methylation （m⁶A）， histone H3 trimethylation levels （H3K4me3， H3K9me3 and H3K36me3）， anti-Müllerian hormone （AMH）， estradiol， lactate， as well as gene expression alteration. The results showed that treatment of TM4 cells with 250 μmol·L^-1 AA2P for 36 h significantly increased cell viability， promoted cell proliferation， reduced early apoptosis， decreased ROS level， enhanced mitochondrial function， altered m⁶A level and histone H3 trimethylation （H3K4me3， H3K9me3 and H3K36me3） levels， promoted the secretion of AMH and estradiol， and reduced lactate level. RNA-seq results revealed that AA2P treatment （250 μmol·L^-1， 36 h） induced significant differential expression of 112 genes， which were involving in multiple GO （gene ontology） items and KEGG （kyoto encyclopedia of genes and genomes） pathways. To sum up， vitamin C could regulate the function and gene expression of mouse TM4 Sertoli cells.

Key words: mouse, TM4 cells, vitamin C, transcriptome, signal pathways

中图分类号:

S865.1+3

王昕昕, 吴子薇, 方婷, 牟巧, 王芳, 赵晗, 杜志强, 杨彩侠. 维生素C调节小鼠TM4支持细胞的功能和基因表达[J]. 中国农业科技导报, 2025, 27(5): 81-89.

Xinxin WANG, Ziwei WU, Ting FANG, Qiao MOU, Fang WANG, Han ZHAO, Zhiqiang DU, Caixia YANG. Vitamin C Modulates Function and Gene Expression of Mouse TM4 Sertoli Cells[J]. Journal of Agricultural Science and Technology, 2025, 27(5): 81-89.

图/表 7

表1 定量PCR引物信息

Table 1 Primer sequences for RT-qPCR

基因名称

Gene name

引物序列

Prime sequence （5’-3’）

Gapdh

F： AGGTCGGTGTGAACGGATTTG

R： TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA

Adra1d

F： AGGTCGGTGTGAACGGATTTG

R： TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA

Gbp2

F： CTGCTAAACTTCGGGAACAGGA

R： AGAGAGCTTGGCAGAGAGGT

Inca1

F： CCAATTCTGAGGGCCACTGAT

R： TAACTCGGGCTGGAATGCTT

Mapkapk5

F： GCTGATGATGGATAAGGCGGT

R： TACCGTCCTTTGGCTTGGTG

Nos3

F： CCACTGAGCAGCTATTGGGT

R： TGCAGTCCCGAGCATCAAAT

Npas4

F： ACCAGATCAACGCCGAGATT

R： CACCATAGAGTGGCCCAGAT

Scand1

F： CGGGTCGAGACGCAGG

R： GTAGGGCGCCGTGTTCAAA

Tmem30c

F： AACTGTACCGCCGACTGAAG

R： CCCCCGTCACTGTGTAAGTC

Trim34a

F： GGAGGTGAGGGTCCAAAGATTC

R： GAGGCCATTATGTTGCCCCT

图1 AA2P对小鼠TM4细胞活力、增殖和凋亡的影响A：不同AA2P处理TM4细胞不同时间的代表图，比例尺100 μm；B：细胞存活率；C：细胞增殖代表图，比例尺20μm；D：细胞凋亡代表图，比例尺50 μm；E：细胞增殖率；F：细胞凋亡率。* 、**和***分别表示在P<0.05、P<0.01和P<0.001水平差异显著

Fig. 1 Effects of AA2P on the viability， proliferation and apoptosis of mouse TM4 cellsA： Representative plots of TM4 cells treated with different AA2P treatments for different time with scale bar 100 μm； B： Cell viability； C： Representative images of EdU assay with scale bar 20 and 50 μm； D： Representative images of Annexin V assay with scale bar 50 μm； E： Proliferation rate of cell； F： Apoptosis rate of cell. *， ** and *** indicate significant differences at P<0.05， P<0.01 and P<0.001 levels， respectively

图2 AA2P对小鼠TM4细胞ROS水平和线粒体功能的影响A~C：ROS、MitoTracker和RH123染色的代表图像，比例尺50 μm；D~F： ROS、MitoTracker 和RH123染色的相对荧光强度。*和**分别表示在P<0.05和P<0.01水平差异显著

Fig. 2 ROS level and mitochondrial features of mouse TM4 cells treated by AA2PA~C： Representative images of ROS， MitoTracker and RH123 staining with scale bar 50 μm； D~F： Relative fluorescence intensities of ROS， MitoTracker and RH123 staining. * and ** indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01 levels， respectively

图3 AA2P对小鼠TM4细胞m6A甲基化和组蛋白H3赖氨酸4、9和36位点三甲基化的影响A、C、E、G：免疫荧光染色代表图像，比例尺20 μm；B、D、F、H：相对荧光强度柱状图。*和***分别表示在P<0.05和P<0.001水平差异显著

Fig. 3 Global levels of nucleic acid m6A methylation and histone H3 trimethylation at sites of lysine 4， 9 and 36 in mouse TM4 cells treated by AA2PA， C， E， G： Immunofluorescence staining represents images with scale bar 20 μm； B， D， F， H： Histogram of relative fluorescence intensity. * and ** indicate significant differences at P<0.05 and P<0.001 levels， respectively

图4 AA2P处理下小鼠TM4细胞的激素和乳酸水平注：*和**分别表示在P<0.05和P<0.01水平差异显著。

Fig. 4 Levels of hormones and lactate in mouse TM4 cells treated by AA2PNote：* and ** indicate significant differences at P<0.05 and P<0.01 levels， respectively.

图5 RNA-seq鉴定AA2P处理小鼠TM4细胞改变的基因和分子通路A：DEGs数量；B：DEGs热图；C：显著富集的GO通路；D：重点GO条目中的部分DEGs；E：显著富集的KEGG通路

Fig. 5 RNA-seq identified genes and molecular pathways altered by AA2P treatment of mouse TM4 cellsA： Number of DEGs； B： Heatmap of DEGs； C： Significantly enriched GO term； D： Partial DEGs involved in some key GO terms； E： Significantly enriched KEGG signaling pathways

图6 显著差异表达基因的验证A：RNA-seq检测DEGs表达和差异；B：RT-qPCR验证DEGs表达和差异。*、**和***分别表示在P<0.05、P<0.01和P<0.001水平差异显著

Fig. 6 Validation of selected DEGsA： Expression and difference of DEGs as detected by RNA-seq； B： Validation of expression and difference of DEGs by RT-qPCR. *， ** and *** indicate significant differences at P<0.05， P<0.01 and P<0.001 levels， respectively

参考文献 14

1	REIS M M S, MOREIRA A C, SOUSA M, et al.. Sertoli cell as a model in male reproductive toxicology: advantages and disadvantages [J]. J. Appl. Toxicol., 2015, 35(8): 870-883.
2	MATHER J P, ZHUANG L Z, PEREZ-INFANTE V, et al.. Culture of testicular cells in hormone-supplemented serum-free medium [J]. Ann. N. Y. Acad. Sci., 1982, 383: 44-68.
3	AGUIRRE-ARIAS M V, VELARDE V, MORENO R D. Effects of ascorbic acid on spermatogenesis and sperm parameters in diabetic rats [J]. Cell Tissue Res., 2017, 370(2): 305-317.
4	SADEGHZADEH F, MEHRANJANI M S, MAHMOODI M. Vitamin C ameliorates the adverse effects of dexamethasone on sperm motility, testosterone level, and spermatogenesis indexes in mice [J]. Hum. Exp. Toxicol., 2019, 38(4): 409-418.
5	EIDAN S M. Effect on post-cryopreserved semen characteristics of Holstein bulls of adding combinations of vitamin C and either catalase or reduced glutathione to tris extender [J]. Anim. Reprod. Sci., 2016, 167: 1-7.
6	YU X X, LIU Y H, LIU X M, et al.. Ascorbic acid induces global epigenetic reprogramming to promote meiotic maturation and developmental competence of porcine oocytes [J/OL]. Sci. Rep., 2018, 8(1): 6132 [2024-06-20]. .
7	YANG Y W, CHEN L, MOU Q, et al.. Ascorbic acid promotes the reproductive function of porcine immature sertoli cells through transcriptome reprogramming [J]. Theriogenology, 2020, 158: 309-320.
8	YANG C X, YANG Y W, MOU Q, et al.. Global change of microRNA expression induced by vitamin C treatment on immature boar Sertoli cells [J]. Theriogenology, 2022, 183: 1-9.
9	YANG C X, YANG Y W, MOU Q, et al.. Proteomic changes induced by ascorbic acid treatment on porcine immature Sertoli cells [J]. Theriogenology, 2022, 188: 13-21.
10	MOU Q, YANG Y W, CHEN L, et al.. Melatonin mitigates chloroquine-induced defects in porcine immature sertoli cells [J]. Theriogenology, 2022, 177: 1-10.
11	LYKKESFELDT J, MICHELS A J, FREI B. Vitamin C [J]. Adv. Nutr., 2014, 5: 16-18.
12	ANGULO C, MALDONADO R, PULGAR E, et al.. Vitamin C and oxidative stress in the seminiferous epithelium [J]. Biol. Res., 2011, 44(2): 169-180.
13	ZHANG B, PAN C, FENG C, et al.. Role of mitochondrial reactive oxygen species in homeostasis regulation [J]. Redox Rep., 2022, 27(1): 45-52.
14	GAUTAM M, BHATTACHARYA I, RAI U, et al.. Hormone induced differential transcriptome analysis of sertoli cells during postnatal maturation of rat testes [J/OL]. PLoS One, 2018, 13(1): e0191201 [2024-06-20]. .

[1]	陈永孜, 王化, 王维轩. 空间转录组学的发展及其应用进展[J]. 中国农业科技导报, 2024, 26(11): 23-31.
[2]	夏雪岩, 崔纪菡, 黄玫红, 郭帅, 刘猛, 赵宇, 鲁一薇, 赵文庆, 王京新, 李顺国. 谷子苗期氮高效转录组分析与基因挖掘[J]. 中国农业科技导报, 2024, 26(10): 41-57.
[3]	韩鹏勇1,2,塔娜1,宝鲁日1,于海泉1*. 小鼠黑色素瘤功能异常CD8+ T细胞基因调控网络构建与分析[J]. 中国农业科技导报, 2019, 21(3): 42-47.
[4]	杨系玲1,姜述君1,马婧1,戴凌燕2,邓本良3,孔祥森4,范文艳1*. 水稻纹枯病菌MAPK级联信号途径分析及信号通路模型预测[J]. 中国农业科技导报, 2017, 19(12): 24-33.
[5]	刘雪姣,徐卫东,马海乐*,姚豪杰,罗娟. 玉米低聚肽对CCl4所致小鼠急性肝损伤的保护作用研究[J]. 中国农业科技导报, 2015, 17(5): 162-167.
[6]	叶幸1,孙群2,刘柱1*. 稻瘟菌侵染过程相关信号通路研究进展[J]. , 2015, 17(1): 87-94.
[7]	王辰,赵为民,牟玉莲*. 调控动物表型microRNA在分子育种中新的重要标记[J]. , 2013, 15(3): 108-112.
[8]	李晓晖,李鑫鑫,张维,燕永亮,陈明,陆伟. 宏转录组学在微生物生态学研究中的应用[J]. , 2011, 13(4): 58-65.
[9]	孙洁宇1,2,高鹏飞2,麻士卫2,杜瑞亭1,王明芳2,. 益生菌Lactobacillus casei Zhang冻干粉对小鼠急性毒性的研究[J]. , 2009, 11(5): 77-82.