中国农业科技导报 ›› 2025, Vol. 27 ›› Issue (6): 83-92.DOI: 10.13304/j.nykjdb.2023.0923
梁丽存1(
), 于会民1, 管晓晨2, 黄火清1, 姚斌1, 杨浩萌1()
收稿日期:2023-12-15
接受日期:2024-03-05
出版日期:2025-06-15
发布日期:2025-06-23
通讯作者:
杨浩萌
作者简介:梁丽存 E-mail：lianglicun1022@163.com；
基金资助:
Licun LIANG1(), Huimin YU1, Xiaochen GUAN2, Huoqing HUANG1, Bin YAO1, Haomeng YANG1()
Received:2023-12-15
Accepted:2024-03-05
Online:2025-06-15
Published:2025-06-23
Contact:
Haomeng YANG
摘要：
塔宾曲霉是一种丝状真菌，在饲料、食品、生物防治、环境修复等领域都有广泛的应用前景。通过形态学观察结合分子检测和Ehrlich试剂染色法，成功地鉴定了1株塔宾曲霉，将其命名为F316。为探索适合F316的基因编辑方法，便于基因工程改造，应用CRISPR/Cas9系统，在F316的孢子色素合成相关基因fwnA的内部插入潮霉素抗性基因，通过孢子颜色统计和抗性基因PCR验证，比较不同基因编辑元件的递送方式对同源重组效率的影响。结果表明，在F316菌株中，表达盒法、自主复制质粒法和核糖核蛋白复合体法3种不同递送方式的同源重组效率分别为70.14%、66.67%和25.70%；另外，供体DNA中同源臂的长度对同源重组效率也有影响，当同源臂长度为2 000 bp时，重组效率最好。
中图分类号:
梁丽存, 于会民, 管晓晨, 黄火清, 姚斌, 杨浩萌. 塔宾曲霉的鉴定及基因编辑方法对其同源重组效率的影响[J]. 中国农业科技导报, 2025, 27(6): 83-92.
Licun LIANG, Huimin YU, Xiaochen GUAN, Huoqing HUANG, Bin YAO, Haomeng YANG. Identification of Aspergillus tubingensis and the Effect of Gene Editing Methods on Its Homologous Recombination Efficiency[J]. Journal of Agricultural Science and Technology, 2025, 27(6): 83-92.
引物名称 Primer name | 引物序列 Primer sequence （5’-3’） | 用途 Usage |
|---|---|---|
| ITS-F | TCCGTAGGTGAACCTGCGC | 扩增ITS序列 |
| ITS-R | TCCT CCGCTTATTGATATGC | Amplification of ITS |
| BenA-F | GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC | 扩增BenA序列 |
| BenA-R | ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC | Amplification of BenA |
| CaM-F | CCGAGTACAAGGAGGCCTTC | 扩增CaM序列 |
| CaM-R | CCGATAGAGGTCATAACGTGG | Amplification of Cam |
| 40-fwn-hph-F | ggtcctccgcctcccagcctacaagtgggatctcaagaactcgacagaagatgatattgaaggagcac | 扩增40 bp同源臂供体DNA |
| 40-fwn-hph-R | ccttgctcaggcagaagttgttggtatagggaatccagtagtatctggaagaggtaaacccgaaacgcg | Amplify 40 bp homologous arm donor DNA |
fwn-up-500-F fwn-dw-500-R | caaccaagctcaaggttccttacgcg tccgcagcagcgcagtcaaag | 扩增500 bp同源臂供体DNA Amplify 500 bp homologous arm donor DNA |
fwn-up-1k-F fwn-dw-1k-R | actctaccgcagttgtttccaattccg gtgataaggcttggaacttgactgcac | 扩增1 kb同源臂供体DNA Amplify 1 kb homologous arm donor DNA |
fwn-up-2k-F fwn-dw-2k-R | cgcagatcgggaacactgcggccgcccactggcaactgtaacacctttgatg cgaaacgcgcgaggcaggcggccgcttcatgtacgggcagttcaatccgtag | 扩增2 kb同源臂供体DNA Amplify 2 kb homologous arm donor DNA |
fwn-dw-F fwn-up-R | ctataccaacaacttctgcctgagcaagg gttcttgagatcccacttgtaggctggg | 扩增上下游同源臂 Amplify upstream and downstream homologous arm |
hph-fu-F hph-fu-R | caggctacaagtgggatctcaagaacgacagaagatgatattgaaggagcactttttg agttgttggtatagggaatccagtagtatctggaagaggtaaacccgaaacg | 潮霉素基因融合 Hygromycin gene fusion |
1K-fwn-F2 1k-fwn-R2 | gctgttggagcgaacctgcaatccctgcg ctcttgctaggagcagcaggggccg | 1 kb同源臂检测引物 1 kb homologous arm detection primers |
500-fwn-F 500-fwn-R2 | cgatgctggccatcaaggcgtccctggc gtgctgttcactgtcaagaataacctcgcg | 500 bp同源臂检测引物 500 bp homologous arm detection primers |
2K-fwn-F 2K-fwn-R | agcgtgctcgtctagtcttgctgctatcc catcataggcgcaaataccacctgcagacc | 2 kb同源臂检测引物 2 kb homologous arm detection primers |
fwn-up-4k-F fwn-dw-4k-R | gggggccctaaatctacatgtgtataaagtgtgcttctcatcgacacggatggggaagg cgaagccccaaatggactgcaggtaatagccggcccacgagccctggcatcaacaatgg | 扩增4 kb同源臂供体DNA Amplify 4 kb homologous arm donor DNA |
HPH-150-R HPH-150-F | gctactgctacaagtggggctgatctgacc cgttggtgtcgatgtcagctccggagttg | 潮霉素基因检测引物 Hygromycin gene detection primers |
5SRNA-F gRNA-R | cacatacgaccacagggtgtg aaaagcaccgactcggtgcc | 扩增gRNA表达盒 Amplify gRNA expression cassette |
Cas9-F Cas9-R | cgagacagcagaatcaccgcccaagttaag attacacttgtattgggatgaattttgtatgcac | 扩增Cas9表达盒 Amplify Cas9 expression cassette |
5s-BglⅡ-F 5s-BglⅡ-R | gcggaacatatactgggcccgggaacacatacgaccacagggtgtgg ctcagcggaaacagctatgaccatgaaaaaaagcaccgactcggtgcc | 扩增gRNA（与Cas9重组） Amplify gRNA（recombination with Cas9） |
Cas9-YZ-F Cas9-YZ-R | ggaacgaactcggttggttgggctg cagaattatcggggttcaggtcaccc | 供体DNA整合检测Detection of donor DNA integration |
fwn gRNA-YZ-F fwn gRNA-YZ-R | cagggtgtggaaaacagggcttccc cggtgccactttttcaagttgata | gRNA整合检测 Detection of gRNA integration |
表1 本研究所用引物 (续表Continued)
Table 1 Primers used in this study
引物名称 Primer name | 引物序列 Primer sequence （5’-3’） | 用途 Usage |
|---|---|---|
| ITS-F | TCCGTAGGTGAACCTGCGC | 扩增ITS序列 |
| ITS-R | TCCT CCGCTTATTGATATGC | Amplification of ITS |
| BenA-F | GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC | 扩增BenA序列 |
| BenA-R | ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC | Amplification of BenA |
| CaM-F | CCGAGTACAAGGAGGCCTTC | 扩增CaM序列 |
| CaM-R | CCGATAGAGGTCATAACGTGG | Amplification of Cam |
| 40-fwn-hph-F | ggtcctccgcctcccagcctacaagtgggatctcaagaactcgacagaagatgatattgaaggagcac | 扩增40 bp同源臂供体DNA |
| 40-fwn-hph-R | ccttgctcaggcagaagttgttggtatagggaatccagtagtatctggaagaggtaaacccgaaacgcg | Amplify 40 bp homologous arm donor DNA |
fwn-up-500-F fwn-dw-500-R | caaccaagctcaaggttccttacgcg tccgcagcagcgcagtcaaag | 扩增500 bp同源臂供体DNA Amplify 500 bp homologous arm donor DNA |
fwn-up-1k-F fwn-dw-1k-R | actctaccgcagttgtttccaattccg gtgataaggcttggaacttgactgcac | 扩增1 kb同源臂供体DNA Amplify 1 kb homologous arm donor DNA |
fwn-up-2k-F fwn-dw-2k-R | cgcagatcgggaacactgcggccgcccactggcaactgtaacacctttgatg cgaaacgcgcgaggcaggcggccgcttcatgtacgggcagttcaatccgtag | 扩增2 kb同源臂供体DNA Amplify 2 kb homologous arm donor DNA |
fwn-dw-F fwn-up-R | ctataccaacaacttctgcctgagcaagg gttcttgagatcccacttgtaggctggg | 扩增上下游同源臂 Amplify upstream and downstream homologous arm |
hph-fu-F hph-fu-R | caggctacaagtgggatctcaagaacgacagaagatgatattgaaggagcactttttg agttgttggtatagggaatccagtagtatctggaagaggtaaacccgaaacg | 潮霉素基因融合 Hygromycin gene fusion |
1K-fwn-F2 1k-fwn-R2 | gctgttggagcgaacctgcaatccctgcg ctcttgctaggagcagcaggggccg | 1 kb同源臂检测引物 1 kb homologous arm detection primers |
500-fwn-F 500-fwn-R2 | cgatgctggccatcaaggcgtccctggc gtgctgttcactgtcaagaataacctcgcg | 500 bp同源臂检测引物 500 bp homologous arm detection primers |
2K-fwn-F 2K-fwn-R | agcgtgctcgtctagtcttgctgctatcc catcataggcgcaaataccacctgcagacc | 2 kb同源臂检测引物 2 kb homologous arm detection primers |
fwn-up-4k-F fwn-dw-4k-R | gggggccctaaatctacatgtgtataaagtgtgcttctcatcgacacggatggggaagg cgaagccccaaatggactgcaggtaatagccggcccacgagccctggcatcaacaatgg | 扩增4 kb同源臂供体DNA Amplify 4 kb homologous arm donor DNA |
HPH-150-R HPH-150-F | gctactgctacaagtggggctgatctgacc cgttggtgtcgatgtcagctccggagttg | 潮霉素基因检测引物 Hygromycin gene detection primers |
5SRNA-F gRNA-R | cacatacgaccacagggtgtg aaaagcaccgactcggtgcc | 扩增gRNA表达盒 Amplify gRNA expression cassette |
Cas9-F Cas9-R | cgagacagcagaatcaccgcccaagttaag attacacttgtattgggatgaattttgtatgcac | 扩增Cas9表达盒 Amplify Cas9 expression cassette |
5s-BglⅡ-F 5s-BglⅡ-R | gcggaacatatactgggcccgggaacacatacgaccacagggtgtgg ctcagcggaaacagctatgaccatgaaaaaaagcaccgactcggtgcc | 扩增gRNA（与Cas9重组） Amplify gRNA（recombination with Cas9） |
Cas9-YZ-F Cas9-YZ-R | ggaacgaactcggttggttgggctg cagaattatcggggttcaggtcaccc | 供体DNA整合检测Detection of donor DNA integration |
fwn gRNA-YZ-F fwn gRNA-YZ-R | cagggtgtggaaaacagggcttccc cggtgccactttttcaagttgata | gRNA整合检测 Detection of gRNA integration |
| 名称Name | 序列Sequence（5’-3’） |
|---|---|
| gRNA-fwn | TAATACGACTCACTATAGGAGTGGGATCTCAAGAACTACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA GTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT |
| 5spro-gRNA-fwn | CACATACGACCACAGGGTGTGGAAAACAGGGCTTCCCGTCCGCTCAGCCGTACTTAA GCCACACGCCGGGAGGTTAGTAGTTGGGTGGGTGACCACCAGCGAATCCCTTCTGTT GTATGAAAGGACGAAACACCAGTGGGATCTCAAGAACTACGTTTTAGAGCTAGAAATA GCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT |
表2 gRNA体外转录模板和体内表达盒的序列信息
Table 2 Sequence information of gRNA both in vitro transcription template and in vivo expression cassette
| 名称Name | 序列Sequence（5’-3’） |
|---|---|
| gRNA-fwn | TAATACGACTCACTATAGGAGTGGGATCTCAAGAACTACGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAA GTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT |
| 5spro-gRNA-fwn | CACATACGACCACAGGGTGTGGAAAACAGGGCTTCCCGTCCGCTCAGCCGTACTTAA GCCACACGCCGGGAGGTTAGTAGTTGGGTGGGTGACCACCAGCGAATCCCTTCTGTT GTATGAAAGGACGAAACACCAGTGGGATCTCAAGAACTACGTTTTAGAGCTAGAAATA GCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTT |
图1 试验流程注：HA—同源臂。
Fig. 1 Experimental processNote： HA—Homologous arm.
图2 F316菌种的形态、Ehrlich染色和系统进化树A：F316菌株的形态特征，1—菌落正面初期， 2—菌落正面， 3—菌落反面，4—菌丝（标尺：20 μm），5—分生孢子头和梗（标尺：20 μm），6—分生孢子 （标尺：20 μm）；B：Ehrlich颜色反应，1—F316，2—黑曲霉；C：基于ITS的菌株系统发育分析；D：基于BenA的菌株系统发育分析；E：基于CaM序列的菌株系统发育分析
Fig. 2 Morphology， Ehrlich staining and phylogenetic analysis of F316 strainA： Morphological characteristics of strain F316， 1— Obverse of young colony， 2—Obverse of Colony， 3—Reverse of colony， 4—Mycelia（bar： 20 μm）， 5—Conidiphore （bar： 20 μm）， 6—Conidium （bar： 20 μm）； B： Ehrlich color reaction， 1—F316， 2—A. tubingensis； C： Phylogenetic analysis based on ITS sequences； D： Phylogenetic analysis based on BenA sequences； E： Phylogenetic analysis based on CaM sequences
图3 PCR扩增、孢子颜色对比及整合效率验证A：表达原件的扩增，1~5为1.6、2.6、3.6、5.6、9.6 kb的donor DNA，6为cas9 表达盒，7为gRNA表达盒；B：转化子及阴阳对照；C：转化子的生长情况；D和E：gRNA和Cas9表达盒整合进基因组的PCR验证，1~22为随机22个孢子
Fig. 3 PCR amplification， spore color comparison and integration efficiency verificationA： Amplification of expression element， 1~5 indicate 1.6，2.6，3.6，5.6，9.6 kb donor DNA， respectively， 6 indicates cas9 expression cassette， 7 indicates gRNA expression cassette；B： Transformants and negative， positive contrast；C： Growth of transformants； D and E： PCR validation of gRNA and Cas9 cassette integrate into the genome， 1~22 indicate 22 spores selected at random
图4 同源重组效率PCR验证及测序结果A：PCR验证，1~24—随机24个孢子；B：测序结果，蓝色碱基序列为gRNA的特异识别序列，1#~6#为基因编辑序列
Fig. 4 Homologous recombination efficiency PCR verification and sequencing resultA： PCR verification， 1~24—24 spores selected at random； B： Sequencing result， the blue base sequence is the specific recognition sequence of gRNA， and 1#~6# are the gene edited sequences
图5 不同长度同源臂的同源重组效率注：不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著。
Fig. 5 Homologous recombination efficiency of different lengths of homologous armNote： Different lowercase letters indicate significant differences at P<0.05 level.
图6 不同递送方式的同源重组效率注：不同小写字母表示在P<0.05水平差异显著。
Fig. 6 HR efficiency of different delivery methodsNote：Different lowercase letters indicate significant difference at P<0.05 level.
| 1 | KHAN S, NADIR S, SHAH Z U, et al.. Biodegradation of polyester polyurethane by Aspergillus tubingensis [J]. Environ. Pollut., 2017, 225(1):469-480. |
| 2 | HUANG D M, SONG Y Y, LIU Y L,et al..A new strain of Aspergillus tubingensis for high-activity pectinase production [J]. Braz. J. Microbiol., 2019,50(1):53-65. |
| 3 | OKADO N, SUGI M, KASAMOTO S, et al.. Safety evaluation of arabinose (arabinan endo-1,5-α-L-arabinanase) from Aspergillus tubingensis [J]. Food Sci. Nutr., 2019, 8(1):456-478. |
| 4 | KRISNAWATI R, CAHYANTO MN, SARDJONO S, et al.. RNA-seq data of Aspergillus tubingensis NBRC 31125 in carbon catabolite repressor related to xylanase production [J/OL]. Data Brief., 2022, 45:108700 [2023-11-20]. . |
| 5 | 郭雷,王聪,郭家才,等.海洋来源塔宾曲霉LWG-42菌株的鉴定及其抗氧化活性化合物的分离[J].微生物学杂志,2017,37(6):30-35. |
| GUO L, WANG C, GUO J C,et al..Identification of marine-derived Aspergillus tubingensis LWG-42 and isolation of its antioxidant active compounds [J]. J. Microbiol., 2017,37(6):30-35. | |
| 6 | WU Y M, YANG X Q, ZHAO T D, et al.. Antifeedant and antifungal activities of metabolites isolated from the coculture of endophytic fungus Aspergillus tubingensis S1120 with red ginseng [J/OL]. Chem Biodivers., 2022, 19(1):e202100608 [2023-11-20]. . |
| 7 | 冯宇航,侯凯丽,姜洋,等.塔宾曲霉L-27菌株代谢产物2,5-呋喃二酮衍生物的分离与除草潜力[J].农药,2023,62(5):387-390. |
| FENG Y H, HOU K L, JIANG Y, et al.. Isolation and herbicidal potential of 2,5-furandione derivatives from Aspergillus tubingensis L-27 metabolites [J]. Agrochemicals, 2023,62(5):387-390. | |
| 8 | SHAN B, HAO R X, XU X Y, et al.. Efficient immobilization behavior and mechanism investigation of Pb(II) by Aspergillus tubingensis [J]. Biotechnol. Lett., 2022,44(5):741-753. |
| 9 | KHAN S, NADIR S, SHAH Z U,et al..Biodegradation of polyester polyurethane by Aspergillus tubingensis [J]. Environ. Pollut., 2017,225:469-480. |
| 10 | MIRHENDI H, ZAREI F, MOTAMEDI M,et al.. Aspergillus tubingensis and Aspergillus niger as the dominant black Aspergillus,use of simple PCR-RFLP for preliminary differentiation [J]. J. De Mycol. Médicale, 2016,26(1):9-16. |
| 11 | 徐圆程.我国南方仓储稻谷中黑曲霉群的分布、产毒与生长特性研究[D].南京:南京财经大学,2021. |
| XU Y C. Distribution, ota-producing and growth characteristics of Aspergillus niger aggregates in stored paddy rice in southern china [D]. Nanjing: Nanjing University of Finance & Economics, 2021. | |
| 12 | SAMSON R A, VISAGIE C M, HOUBRAKEN J, et al.. Phylogeny,identification and nomenclature of the genus Aspergillus [J]. Studies Mycol., 2014,78:141-173. |
| 13 | JIN F J, WANG B T, WANG Z D, et al.. CRISPR/Cas9-Based genome editing and its application in aspergillus species [J]. J Fungi (Basel)., 2022, 8(5):467-478. |
| 14 | SHEN C C, HSU M N, CHANG C W, et al.. Synthetic switch to minimize CRISPR off-target effects by self-restricting Cas9 transcription and translation [J/OL].Nucl. Acids Res.,2019,47(3):e13 [2023-11-20]. . |
| 15 | KWON M J, SCHÜTZE T, SPOHNER S, et al.. Practical guidance for the implementation of the CRISPR genome editing tool in filamentous fungi [J/OL]. Fungal Biol. Biotechnol., 2019,6:15 [2023-11-20]. . |
| 16 | 石庆楠,曾海英,文安燕,等.贵州薏米致霉菌的分离鉴定[J].食品工业科技,2017,38(16):101-105. |
| SHI Q N, ZENG H Y, WEN A Y,et al..Isolation and identification of moldy fungus from coix seed in Guizhou [J]. Sci. Technol. Food Ind., 2017,38(16):101-105. | |
| 17 | FRISVAD J C, SAMSON R A. Polyphasic taxonomy of Penicillium subgenus Penicillium-a guide to identification of food and airborne terverticillate Penicillia and their mycotoxins [J]. Studies Mycol., 2004, 49:174-186. |
| 18 | 高伟欣,黄火清,赵晶,等.应用于基因编辑的核糖核蛋白复合体的构建与活性验证[J].生物技术通报,2022,38(8):60-68. |
| GAO W X, HUANG H Q, ZHAO J,et al..Construction and activity verification of ribonucleoprotein complex for gene editing [J]. Biotechnol. Bull., 2022,38(8):60-68. | |
| 19 | 孔华忠,齐祖同.曲霉属和散囊菌属的新记录[J].真菌学报, 1995,14 (1):75-78. |
| KONG H Z, QI Z T. New records of Aspergillus and Eurotium in China [J]. Acta Mycol. Sin., 1995, 14(1):75-78. | |
| 20 | SAMSON R, HOUBRAKEN J, KUIJPERS A, et al.. New ochratoxin A or sclerotium producing species in Aspergillus section Nigri [J]. Stud. Mycol., 2004, 50(1):45-61. |
| 21 | FLIPPHI M, MÁRTON A, BÍRÓ V, et al.. Mutations in the second alternative oxidase gene:a new approach to group Aspergillus niger strains [J]. J. Fungi (Basel),2023,9(5):570-582. |
| 22 | BAKER O, TSURKAN S, FU J,et al..The contribution of homology arms to nuclease-assisted genome engineering [J]. Nucl. Acids Res., 2017,45(13):8105-8115. |
| [1] | 杨大兵, 胡亮, 杜雪树, 万丙良, 夏明元, 戚华雄, 李进波. CRISPR/Cas9基因编辑技术创制水稻雄性不育系的研究进展[J]. 中国农业科技导报, 2025, 27(3): 24-34. |
| [2] | 孙志康, 李力群, 郝捷, 吴晗, 吴娜, 郑超, 季嫱, 李选文, 陈晨. CRISPRCas系统在枯草芽孢杆菌基因组编辑中的研究进展[J]. 中国农业科技导报, 2025, 27(2): 24-32. |
| [3] | 翟利敏, 李文通, 冯政, 李华, 裴杨莉. 基因编辑猪的研究现状[J]. 中国农业科技导报, 2022, 24(8): 25-34. |
| [4] | 汪海, 赖锦盛, 王海洋, 李新海. 作物智能设计育种——自然变异的智能组合和人工变异的智能创制[J]. 中国农业科技导报, 2022, 24(6): 1-8. |
| [5] | 陈浩, 周菲, 林拥军. 我国作物新种质创制研究进展[J]. 中国农业科技导报, 2022, 24(12): 112-119. |
| [6] | 闫磊, 张金山, 朱健康, 夏兰琴. 基因编辑技术及其在农作物中的应用进展[J]. 中国农业科技导报, 2022, 24(12): 78-89. |
| [7] | 庄重, 赵龙, 白皓, 毕瑜林, 黄应权, 陈国宏, 常国斌. CRISPR/Cas9技术在家禽育种方面的应用[J]. 中国农业科技导报, 2022, 24(1): 14-23. |
| [8] | 马小倩, 杨涛, 张全, 张洪亮. 水稻新型育种技术研究现状与展望[J]. 中国农业科技导报, 2022, 24(1): 24-30. |
| [9] | 廖嘉明, §, 李春梅§, 张石虎, 李布野, 欧阳昆唏, 陈晓阳. CRISPR/Cas9基因编辑技术的发展及其在植物中的应用[J]. 中国农业科技导报, 2021, 23(12): 20-28. |
| [10] | 薛满德,龙艳,裴新梧*. 基因编辑技术及其在作物育种中的应用与安全管理[J]. 中国农业科技导报, 2018, 20(9): 12-22. |
| [11] | 魏景亮,吴添文,阮进学,牟玉莲*. 基因组编辑技术改良家畜的研究进展[J]. , 2014, 16(1): 32-38. |
| 阅读次数 | ||||||
|
全文 |
|
|||||
|
摘要 |
|
|||||
京公网安备11010802021197号 